IME - INTERDISZCIPLINÁRIS MAGYAR EGÉSZSÉGÜGY

Tudományos folyóirat - Az egészségügyi vezetők szaklapja

   +36-1/786–9268       ime@nullimeonline.hu

   +36-1/786–9268

   ime@nullimeonline.hu

Glikomika a modern orvostudományban: Transzlációs aspektusok

  • Cikk címe: Glikomika a modern orvostudományban: Transzlációs aspektusok
  • Szerzők: Döncző Boglárka, Bodnár Judit, Szigeti Márton, Dr. Járvás Gábor, Dr. Hajba László, Prof. Guttman András
  • Intézmények: Horváth Csaba Elválasztástudományi Laboratórium Debreceni Egyetem MMKK, MTA PE Transzlációs Glikomika Kutató Csoport, MTA PE Transzlációs Glikomika Kutató Csoport, MTA PE Transzlációs Glikomika Kutató Csoport, MTA PE Transzlációs Glikomika Kutató Csoport, MTA PE Transzlációs Glikomika Kutató Csoport
  • Évfolyam: XIV. évfolyam
  • Lapszám: 2015. / 6
  • Hónap: július-augusztus
  • Oldal: 24-28
  • Terjedelem: 4
  • Rovat: KLINIKUM
  • Alrovat: GENETIKA

Absztrakt:

Modern átfogó glikozilációs technikák segítségével új lehetőségeket tárhatunk fel a biomarkerek felfedezése frontján, mivel a glikozilációs változások érzékeny indikátorai a biokémiai folyamatok aktuális állapotának. Nagy érzékenységű glikoanalitikai módszerekre a bioterápiás készítmények analízise kapcsán is nagy szükség van. A lézer indukált fluoreszcens detektorral ellátott kapilláris elektroforézis (CE-LIF) exoglikozidáz enzimes emésztéses lépésekkel kombinálva kiváló eszköz glikozilációs profilok és glikánok szerkezetének meghatározására.

Angol absztrakt:

Comprehensive glycosylation analysis offers a new avenue in biomarker discovery as glycosylation changes can be sensitive indicators of the actual state of the underlying biochemical mechanism. High performance glycoanalytical methods are also needed by the biopharmaceutical industry. Capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection (CE-LIF) combined with the use of exoglycosidase digestion steps is an excellent tool to analyse glycosylation profiles of interest and to elucidate their structures.

A cikk további részleteihez előfizetői regisztráció és belépés szükséges! Belépéshez kattintson ide
KLINIKUM GENETIKA Glikomika a modern orvostudományban: Transzlációs aspektusok Döncző Boglárka1, Bodnár Judit2, Szigeti Márton1,2, Dr. Járvás Gábor2, Dr. Hajba László2, Prof. Guttman András1,2, 1 Horváth Csaba Elválasztástudományi Laboratórium, Debreceni Egyetem, MMKK, 2 MTA PE Transzlációs Glikomika Kutató Csoport Modern átfogó glikozilációs technikák segítségével új lehetőségeket tárhatunk fel a biomarkerek felfedezése frontján, mivel a glikozilációs változások érzékeny indikátorai a biokémiai folyamatok aktuális állapotának. Nagy érzékenységű glikoanalitikai módszerekre a bioterápiás készítmények analízise kapcsán is nagy szükség van. A lézer indukált fluoreszcens detektorral ellátott kapilláris elektroforézis (CE-LIF) exoglikozidáz enzimes emésztéses lépésekkel kombinálva kiváló eszköz glikozilációs profilok és glikánok szerkezetének meghatározására. Comprehensive glycosylation analysis offers a new avenue in biomarker discovery as glycosylation changes can be sensitive indicators of the actual state of the underlying biochemical mechanism. High performance glycoanalytical methods are also needed by the biopharmaceutical industry. Capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection (CE-LIF) combined with the use of exoglycosidase digestion steps is an excellent tool to analyse glycosylation profiles of interest and to elucidate their structures. BEVEZETÉS A glikomika kifejezés a görögből átvett, a cukrok édességét jelentő, „glyco-” szócskából és a korunkban oly gyakran használt -omics végződésből tevődik össze. A glikomika azon szakterületeket egyesíti, melyek a biológiai rendszerek szénhidrát struktúráit és funkcióit tanulmányozzák [1]. A fehérjék glikozilációja több mint 600 enzim működésének eredménye. Ezen enzimek génjeiben vagy azok promoter régióiban jelentkező mutációk jelentősen megváltoztathatják a fehérjék glikozilációját, mely hatással lehet az egyedek egészségi állapotára, de bizonyos esetekben akár letális is lehet, mint például a kongenitális glikozilációs defektus (CGD) szindróma esetén [2]. A glikoziláció fontos szerepet játszik a fehérjék orientációjában, védelmében (pl. proteázok ellen), befolyásolja a specifikus és nem specifikus interakciókat, növeli a fehérje stabilitását, részt vesz a szignáltranszdukciós folyamatokban illetve a sejtek közötti kommunikációban, hogy csak a legfontosabbakat említsük (1. ábra) [3]. 24 IME XIV. ÉVFOLYAM 6. SZÁM 2015. JÚLIUS-AUGUSZTUS 1. ábra A sejtfelszíni komplex cukrok szerepe a sejt-sejt, hormon-sejt, vírus-sejt, toxin-sejt és baktérium-sejt kommunikációban. A fehérjéken található fő szénhidrát típusok az aszparaginhoz (N-), valamint a szerinhez vagy treoninhoz (O-) kötött cukrok (2. ábra). Az N-kötött cukorszerkezetek endoglikozidációs kezeléssel (például Peptide-N-Glycosidase F) specifikusan lehasíthatóak a fehérjékről. A szénhidrát struktúrát felépítő monoszacharidok kapcsolódása a kötő cukor molekula 2, 3, 4, 6 és 8-as pozíciójában α-, valamint β-glikozidos kötéssel mehet végbe, ami több mint 30 féle kapcsolódásra ad módot. A kötési lehetőségek változatosságából következik, hogy rendkívül bonyolult glikán struktúrák jöhetnek létre, melyek humán sejtekben többnyire N-acetil-glükózamin (GlcNAc), N-acetil-galaktózamin (GalNAc), galaktóz (Gal), fukóz (Fuc), mannóz (Man) és N-acetil-neuraminsavból (szilálsav) (NeuNAc), alegységekből épülnek fel. Az aszparaginhoz kötött cukorszerkezetek először kotranszlációval egy 14 cukormolekulából álló prekurzorként kötődnek a polipeptid lánchoz. Ez a jellemző struktúra, három glükózt, kilenc mannózt, és két N-acetil-glükózamin molekulát tartalmaz. Az elágazó láncú prekurzor molekula egy komplex reakcióban úgy kapcsolódik a hordozó molekulához, hogy a cukor struktúra a polipeptid lánc megfelelő pontjaival lép kölcsönhatásba, miközben a létrejött új konjugátum az endoplazmatikus retikulum (ER) lumenébe transzlokálódik, ahol további térbeli módosulásokon megy keresztül. Az addíciós reakciót követően – miután a fehérje felvette a megfelelő térszerkezetet – a három glükóz eltávolításával a fehérje képessé válik az ER-ból való exportra. A fehérje ezután a Golgi-apparátusba jut, ahol további mannóz egységek eltávolításával létrejön az ún. core N-linked struktúra, mely három mannózt és két N-acetil-glükózamint tartalmaz. Ehhez a szerkezethez különböző monoszacharidok kapcso- KLINIKUM GENETIKA 2. ábra Aszparaginhoz (ASN) kötött (N-linked) és szerinhez vagy treoninhoz (SER/THR) kötött (O-linked) glikán struktúrák. lásával a sejt további változatos szerkezetű glikán struktúrákat alakít ki. A cukorszerkezetek analízisének rendkívül nagy szerepe van biológiai terápiás készítmények fejlesztése és gyártása során. Az Evaluate Pharma [4] kimutatása szerint míg 2008-ban az első öt legnagyobb bevételű gyógyszer készítményből csak egy volt terápiás készítmény, addig 2014 végére már az első öt gyógyszer terápiás készítmény volt. Ezen felül, újabb kutatások kimutatták, hogy a daganatos megbetegedések hatására történő glikán szerkezet módosulás analízise egy új irányt jelenthet a korai diagnosztikában és a posztoperációs kezelésekben. A terápiás fehérjék gyártása során felmerülő problémák, például az aggregáció, a hibás térszerkezet, a különböző szerkezeti és aminosav valamint glikozilációs módosulások a gyógyszer hatóanyag tartalmának csökkenéséhez, vagy akár káros következményekhez vezethetnek. A glikozilációban történt változások nyomon követése a rekombináns DNS alapú termékek előállítása során a klónszelekciótól a minőségellenőrzésig minden lépésben rendkívüli fontossággal bír a folyamatok és termékek ellenőrzése, valamint optimalizálása kapcsán [5]. A terápiás fehérjék közül kiemelt jelentőséggel bírnak az immunoglobulinok, pl. IgG1, amely egy konzervált, – aszparaginhoz kötött – glikozilációs pozícióval rendelkezik (Asn 297), nagy variábilitást mutatva különböző expressziós sejt típusok és körülmények esetén. Az immunoglobulin G fehérje molekula szerkezetében történő glikozilációs változások meghatározzák ezek bizonyos sajátosságait, pl. a fizikai-kémiai tulajdonságukat, az antitestfüggő sejtek által közvetített citotoxicitás (ADCC) és a komplement-függő citoto- xicitás (CDC) funkcióikat. A core N-glikan szerkezethez (GlcNAc2Man3) kötődő fukóz exponenciálisan csökkenő ADCC aktivitást vált ki, a sziálsav (N-acetil-neuraminsav) jelenléte szintén csökkent ADCC aktivitást és gyulladás csökkentő hatást okoz, az N-acetil-glükózamin, illetve mannóz kötődése ligandumként szolgál mannóz kötő fehérjék számára, a galaktóz kötődésének pedig a placenta transzport folyamataiban van jelentősége, illetve megnövekedett CDC aktivitást vált ki. A fehérjék cukorszerkezetének vizsgálata kiemelt fontosságú a rákdiagnosztikai kutatásokban is, mivel nemrég indult vizsgálatok felfedték a glikán szerkezet módosulása és a daganatos megbetegedések közötti összefüggéseket. Az átfogó glikozilációs analízis révén új lehetőségek válnak elérhetővé a biomarkerek felfedezésében, mivel a glikozilációs változások érzékeny indikátorai egyes fontos biokémiai folyamatok aktuális állapotának. A primer daganatokból leszakadó tumor sejtek – az ún. cirkuláló ráksejtek (CTC) – vérből történő elválasztását és glikán analízisét követően a remények szerint nem csak a rákos betegség jelenlétéről lehet majd információt kapni, hanem annak típusáról és forrásáról is még az előtt, hogy a hagyományos képalkotó rendszerekkel a megbetegedés kimutatható lenne. GLIKÁN ANALÍZIS A komplex szénhidrátok analízise komoly analitikai kihívást jelent, mivel a cukrok sem kromofór, sem fluorofór csoportokat nem tartalmaznak, és a legnagyobb részt nincs elektromos töltésük sem. Számos nagyműszeres analitikai módszer – továbbá azok kapcsolása – alkalmazható cukor IME XIV. ÉVFOLYAM 6. SZÁM 2015. JÚLIUS-AUGUSZTUS 25 KLINIKUM GENETIKA 3. ábra Glikoproteinek komplex szénhidrát struktúrájának meghatározása szerkezetvizsgálati célra, ezek közül a legelterjedtebbek a HPLC/UHPLC (normál fázisú és HILIC), a HPLC-MS, valamint a kapilláris-elektroforézis (CE) és kapilláris-elektroforézis –MS (CE-MS) alkalmazása. Míg a HPLC rendszereknél a felszabadított glikán struktúrákat – a megfelelő származék képzés után – a nyomás hajtja végig az elválasztást végző oszlopon és az elválasztás kromatográfiás alapon történik, addig az elektroforézisnél a differenciális elektromigráció az elválasztás alapja [6]. A kapilláris elektroforézis elválasztási módszer elve, hogy az elektromos térben a töltött részecskék/molekulák eltérő sebességgel, tömeg-töltés arányuknak megfelelően vándorolnak. A szeparációt általában egy 25-100 μm belső átmérőjű, megfelelő puffer oldattal töltött kapillárisban végzik. Az elektroforetikus elválasztási módszer egyik legnagyobb előnye, hogy azonos szerkezetű és molekulasúlyú, de különböző konformációjú molekulákat képes elválasztani egymástól, eltérő hidrodinamikai térfogatuk alapján (eltérő migrációs sebesség). A kapilláris elektroforézis berendezés egy nagyfeszültségű tápegységből, az elektrolit oldatot tartalmazó edényekből, az elválasztó kapillárisból, valamint egy detektorból és a hozzá tartozó adatfeldolgozó egységből áll. A kapillárisra kapcsolt nagyfeszültség hatására – mely optimálisan 100 – 1000 V/cm között változtatható – megfelelően magas pH-jú pufferoldatban kialakul az ún. elektroozmotikus áramlás (EOF), melynek dugószerű áramlásával az elválasztás elérhető elméleti tányérszáma meghaladhatja a 106 értéket is. Az elválasztás hatékonysága növelhető az EOF szabályozásával, melyet az elektromos tér, a pH, az ionerősség, a termosztálási hőmérséklet változtatásával, különböző felületaktív anyagok adagolásával, valamint különleges bevonattal rendelkező kapillárisok alkalmazásával érhetünk el. A detektálási módszer lehet UV/VIS, fluoresz- 26 IME XIV. ÉVFOLYAM 6. SZÁM 2015. JÚLIUS-AUGUSZTUS cencia, lézer indukált fluoreszcencia, amperometria, vezetőképesség mérés és tömegspektrometria. Komplex szénhidrátok analízisére leggyakrabban lézer indukált fluoreszcencián (LIF) alapuló detektálási módszert alkalmaznak, mely rendkívül nagy érzékenységű, azonban a minta származék képzésére van szükség, leggyakrabban aminopirén-triszulfonsavval. Az aszparaginhoz kötött glikán struktúrák meghatározásának az egyik leginkább bevált módja, hogy a cukrokat PNGase F enzimmel levágják, majd a maradék polipeptidtől etanol precipitációval, membránszűréssel, vagy speciálisan bevont mágneses bead-ek (pl COOH csoportot tartalmazó mágneses Fe3O4 golyók) segítségével megtisztítják a mintát. A megtisztított cukormintát ezután aminopirén-triszulfonsav (APTS) fluoreszcens festékkel jelölik. Az APTS jelölés előnyei közé tartozik, hogy egy nagy hatékonyságú (>90%) egylépéses reakcióval könnyen megvalósítható, csak a cukor redukáló végéhez kötődik, nem szelektív – a glikán struktúráktól függetlenül kapcsolódik –, valamint könnyen kvantifikálható – mivel minden cukormolekulához csak egy flurofór kötődik. Az APTS fluoreszcensen gerjeszthető a gyakran használt 488 nm–es lézerrel, a cukorkonjugátumok emissziós hullámhossza pedig 520 nm körül van. A glikoproteinek komplex szénhidrátstruktúrájának elemzési folyamatábrája a 3. ábrán látható. TRANSZLÁCIÓS GLIKOMIKA A daganatos elváltozások hatására létrejövő glikán struktúra változások jól nyomon követhetőek lézer indukált fluorescens detektorral ellátott kapilláris elektroforézis (CELIF) és exoglikozidáz enzimes emésztés kombinációjával. A módszer mind glikozilációs profilok meghatározására, mind pedig szénhidrát szekvenálásra alkalmazható. Az analitikai KLINIKUM GENETIKA 4. ábra Egy egészséges egyén és egy prosztatarákban szenvedő beteg N-linked glikán profilja (bal oldal), és az álválasztást végző mikrofluidikai rendszer sémája (jobb oldal) módszer további előnye, hogy megvalósítható integrált mikrofluidikai rendszerben is, mint az a 4. ábra jobb oldali paneljén látható. Ugyanezen ábra baloldali részén egy egészséges valamint egy prosztatarákos páciens mikrofluidikai rendszerrel meghatározott glikán profilja látható (4. ábra) [7]. A felvett elektroferogramokon jól látszanak a glikozilációs elváltozások, melyek eltérő csúcsintenzitások, eltolódások és új csúcsok formájában (A,B,C,D) jelennek meg. A pontos szénhidrát-szerkezet meghatározása a struktúrát alkotó cukrok egyenkénti enzimes emésztése után felvett elektroferogramok csúcsainak eltolódásából, illetve a rendszer tömegspektrométerhez való csatlakoztatásával, ún. CE-MS alkalmazásával valósítható meg [8]. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozunk a Magyar Tudományos Akadémiának a Lendület #97101 számú pályázat (MTA-PE Transzlációs Glikomika Kutatócsoport) keretében nyújtott anyagi támogatásért. IRODALOMJEGYZÉK [1] Turnbull, J.E. and. Field RA: Emerging glycomics technologies, Nat Chem Biol, 2007, 3(2): p. 74-77. [2] Jaeken, J: Congenital disorders of glycosylation. Year in Human and Medical Genetics: New Trends in Mendelian Genetics, 2010, 1214: p. 190-198. [3] Varki A, et al., editors.: Essentials of Glycobiology, 2009, Cold Spring Harbor NY. [4] Available from: http://www.evaluategroup.com/public/EvaluatePharmaOverview.aspx. [5] Guttman, A: Capillary electrophoresis in the N-glycosylation analysis of biopharmaceuticals, Trac-Trends in Analytical Chemistry, 2013, 48: p. 132-143. [6] Rakus, JF, Mahal, LK: New Technologies for Glycomic Analysis: Toward a Systematic Understanding of the Glycome, Annual Review of Analytical Chemistry, Vol 4, 2011, 4: p. 367-392. [7] Olajos, M, et al.: Sample preparation for the analysis of complex carbohydrates by multicapillary gel electrophoresis with light-emitting diode induced fluorescence detection, Anal Chem, 2008, 80(11): p. 4241-6. [8] Jarvas, G, Guttman, A, Foret, F: Numerical modeling of capillary electrophoresis – electrospray mass spectrometry interface design, Mass Spectrometry Reviews, 2014, p. n/a-n/a. IME XIV. ÉVFOLYAM 6. SZÁM 2015. JÚLIUS-AUGUSZTUS 27 KLINIKUM GENETIKA A SZERZŐK BEMUTATÁSA 28 Döncző Boglárka a Debreceni Egyetemen 2009-ben diplomázott Biológia BSc, majd 2012-ben Biológiatanárföldrajztanár MSc szakon. Tanulmányai ideje alatt a Természettudományi és Technológiai Kar Biokémiai majd Növénytani Tanszékein szakdolgozott, ahol glikoprotein építőelemek szintézisében vett részt és az oligoszacharidok szerepeit vizsgálta biológiai rendszerekben. Jelenleg a Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola PhD hallgatója. Kutatási területe a fluorofórral jelölt N-glikán struktúrák szintézise és kapilláris elektroforetikus analízise. Bodnár Judit 2011-ben szerezte meg a Debreceni Egyetemen a Kémia BSc, majd 2013-ban a Vegyész MSc diplomáját analitikus szakirányon. Ezt követően a Debreceni Egyetem Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékén dolgozott tudományos segédmunkatársként, ahol az orvosi diagnosztikában és terápiában alkalmazott fémkomplexek egyensúlyi, kinetikai, relaxációs és szerkezeti sajátságait vizsgálta. Jelenleg az MTA-PE Transzlációs Glikomika kutatócsoportban folytatja PhD tanulmányait, ahol kutatási területe a keringő ráksejtek befogása és glikomikai vizsgálata integrált mikrofluidikai rendszerekkel. Szigeti Márton 2013-ban szerezte meg Biomérnök BSc illetve 2014-ben a Környezetmérnök MSc diplomáját a Pannon Egyetemen. Jelenleg a Debreceni Egyetem Horváth Csabáról elne- vezett Elválasztástechnikai Kutatólaboratóriumában PhD hallgató ahol kutatási területei a molekuláris biológiára, a fluoreszcens mikroszkópiára, a kapilláris elektroforézisre, PCR technikára, valamint a projektben felmerülő analitikai feladatok megoldására fókuszálnak. Dr. Járvás Gábor 2007-ban szerezte meg vegyészmérnöki diplomáját a Pannon Egyetemen finom-kémia és szerves vegyipar szakirányokon. 2010től a Pannon Egyetem tudományos segédmunkatársaként dolgozott a Fizikai Kémia Intézeti Tanszéken, ahol fázisegyensúlyi tulajdonságok becslésével foglalkozott. PhD fokozatot 2012-ben szerzett, majd csatlakozott az MTA-PE Transzlációs Glikomika Kutatócsoporthoz, ahol mikrofluidikai eszközök numerikus áramlástani vizsgálatával foglalkozik. Dr. Hajba László 1998-ban szerzett okleveles vegyészmérnöki diplomát (MSc) illetve 2008-ban kémia tudományágban doktori fokozatot (PhD) a Pannon Egyetemen. Jelenleg az MTA- PE Traszlációs Glikomika Kutatócsoportban dolgozik kutatóként, ahol kutatási területe integrált mikrofluidikai eszközök cirkuláló ráksejtek befogására illetve analízisére. Több éves tapasztalata van a rezgési spektroszkópia és a kemometria területén. Prof. Guttman András a Pannon Egyetem Műszaki Informatika Karán működő MTA-PE Transzlációs Glikomika Kutatócsoport szakmai irányítása és operatív vezetése mellett, irányítja a Debreceni Egyetemen működő Horváth Csaba Bioszeparációs Laboratóriumot (HLBS). A HLBS létrehozását megelőzően a Torrey Mesa Kutatóinté- zetnél (Torrey Mesa Research Institute, La Jolla, CA), a Genetic BioSystems cégnél (San Diego, CA) és a Beckman Coulter cégnél (Fullerton, CA) kapilláris elektroforézis rendszerek fejlesztésével foglalkozott. Számos nemzetközi tudományos folyóirat szerkesztőbizottsági tagja, vendégprofeszszor a bostoni Northeastern Egyetemen valamint a San Diego-i Scripps Research Institute-ban. 2004-től a Magyar Tudományos Akadémia külső tagja. IME XIV. ÉVFOLYAM 6. SZÁM 2015. JÚLIUS-AUGUSZTUS