IME - INTERDISZCIPLINÁRIS MAGYAR EGÉSZSÉGÜGY

Tudományos folyóirat - Az egészségügyi vezetők szaklapja

   +36-1/786–9268       ime@nullimeonline.hu

   +36-1/786–9268

   ime@nullimeonline.hu

Perspektívák a nozokomiális infekciók mikrobiológiai diagnosztikájában

  • Cikk címe: Perspektívák a nozokomiális infekciók mikrobiológiai diagnosztikájában
  • Szerzők: Dr. Iván Miklós Ábel, Dr. Vásárhelyi Barna, Dr. Kristóf Katalin
  • Intézmények: Semmelweis Egyetem Laboratóriumi Medicina Intézet, Semmelweis Egyetem Laboratóriumi Medicina Intézet Mikrobiológiai Laboratórium
  • Évfolyam: XIV. évfolyam
  • Lapszám: 2015. / 9
  • Hónap: november
  • Oldal: 41-44
  • Terjedelem: 4
  • Rovat: LABORATÓRIUMI DIAGNOSZTIKA
  • Alrovat: LABORATÓRIUMI DIAGNOSZTIKA

Absztrakt:

Az antimikrobás szerek többségével szemben rezisztens kórokozók súlyos problémát – nozokomiális infekciót – okoznak a kórházakban. Nehezen kezelhető fertőzéseket okozva növelik a kezelési költségeket, a morbiditást és a mortalitást. Korai kimutatásuk esetén a fertőzések, helyi járványok hatékonyabban kontrollálhatók. A modern diagnosztikában helyet kapnak a klasszikus tenyésztéses módszerek (szelektív táptalajok); a betegágy mellett használható gyorstesztek; a mikroorganizmusok azonosítására alkalmas tömegspektrométer (MALDI-TOF); illetve speciális molekuláris biológiai eljárások. A jövőben újabb technikák, pl. a teljes baktérium-genom szekvenálás, az optoelektromos film array, vagy real-time automatizált mikroszkópia megjelenése és elterjedése várható. A diagnosztikától függetlenül továbbra is a megelőzés az, amivel a multirezisztens kórokozók okozta veszély csökkenthető.

Angol absztrakt:

The increasing prevalence of pathogens resistant against the majority of antimicrobial agents cause severe problem – nosocomial infection – in health care institutes. The resulting infections are hardly controlled and increase treatment costs, morbidity and mortality. The early detection provides an option for a better efficacy in controlling local epidemics. Modern diagnostic options include classic cultures (using selective broths); point-of-care quick tests; mass spectrometry suitable for the identification of microorganisms (MALDI-TOF); and specific molecular biology procedures. One can expect the emergence and spread of novel diagnostic techniques such as whole genomic sequencing of the bacterial genome; optoelectric film array, or real-time automated microscopy in microbiological laboratories. Irrespectively of diagnostic opportunities, however, still the prevention provides the most cost-effective tool in controlling risk of multi-resistant pathogens.

A cikk további részleteihez előfizetői regisztráció és belépés szükséges! Belépéshez kattintson ide
LABORDIAGNOSZTIKA Perspektívák a nozokomiális infekciók mikrobiológiai diagnosztikájában Dr. Iván Miklós Ábel, Dr. Vásárhelyi Barna, Dr. Kristóf Katalin, Semmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet Az antimikrobás szerek többségével szemben rezisztens kórokozók súlyos problémát – nozokomiális infekciót – okoznak a kórházakban. Nehezen kezelhető fertőzéseket okozva növelik a kezelési költségeket, a morbiditást és a mortalitást. Korai kimutatásuk esetén a fertőzések, helyi járványok hatékonyabban kontrollálhatók. A modern diagnosztikában helyet kapnak a klasszikus tenyésztéses módszerek (szelektív táptalajok); a betegágy mellett használható gyorstesztek; a mikroorganizmusok azonosítására alkalmas tömegspektrométer (MALDI-TOF); illetve speciális molekuláris biológiai eljárások. A jövőben újabb technikák, pl. a teljes baktérium-genom szekvenálás, az optoelektromos film array, vagy real-time automatizált mikroszkópia megjelenése és elterjedése várható. A diagnosztikától függetlenül továbbra is a megelőzés az, amivel a multirezisztens kórokozók okozta veszély csökkenthető. The increasing prevalence of pathogens resistant against the majority of antimicrobial agents cause severe problem – nosocomial infection – in health care institutes. The resulting infections are hardly controlled and increase treatment costs, morbidity and mortality. The early detection provides an option for a better efficacy in controlling local epidemics. Modern diagnostic options include classic cultures (using selective broths); point-of-care quick tests; mass spectrometry suitable for the identification of microorganisms (MALDI-TOF); and specific molecular biology procedures. One can expect the emergence and spread of novel diagnostic techniques such as whole genomic sequencing of the bacterial genome; optoelectric film array, or real-time automated microscopy in microbiological laboratories. Irrespectively of diagnostic opportunities, however, still the prevention provides the most cost-effective tool in controlling risk of multi-resistant pathogens. BEVEZETÉS Az utóbbi évtizedekben egyre nyilvánvalóbb: az aktuálisan vagy a közeljövőben rendelkezésre álló antimikrobiális szerek lassan hatástalanok bizonyos kórokozókra. Ezek (elsősorban baktériumok) kórházi környezetben szelektálódnak, majd a betegről (leginkább a személyzet közvetítésével) másik betegre terjednek – kórházon belüli fertőzéseket, ún. nozokomiális infekciót hozva létre. Ezt összefoglaló néven ʼHealthcare Associated Infectionʼ (HAI) is emlegetik [1]. A multirezisztens (csak 1 vagy 2 hatóanyagcsoportra érzékeny) kórokozók megjelenése részben a következetlen antibiotikum adás eredménye. A gondok az elmaradottabb egészségüggyel rendelkező országokat fokozottan sújtják még akkor is, ha kevesebb antibiotikumot használnak [2], leginkább azért, mert nem költenek a megfelelő számú ápolóra és korszerű védőeszközökre, nem izolálják a hordozó betegeket. Hazánk lakossági antibiotikum fogyasztása az Európai Uniós átlag mindössze kb. kétharmada [3], azonban a multirezisztens nozokomiális infekciók prevalenciája nemzetközi viszonylatban is magas: 2014-ben közel 4000 ilyen esetet jelentettek [4]. Magyarországon a legnagyobb gondot HAI viszonylatban baktériumok közül a methicillin rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA), a vancomycin rezisztens Entero-coccus faecalis (VRE), a Clostridium difficile, a multirezisztens Acinetobacter baumannii (MACI) és Pseudomonas aeruginosa (MPAE), az ESBL termelő, valamint egyes ritkább, a karbapenemáz termelő Enterobacteriaceae családba tartozó fajok okozzák. A fentieket ESCAPE baktériumoknak vagy egyszerűen „superbugoknak” is nevezik. Vírusok tekintetében a Calicivírus és a Rotavírus felelős a legtöbb megbetegedésért és kórházi ápolási napért [4], halált azonban ritkán okoznak. Gombák közül elsősorban a Candida glabrata, illetve több Aspergillus faj esetén emelkedő a rezisztencia gyakorisága. Nagyobb gyakorisággal fordulnak elő a legtöbb antimikotikummal szemben természetes rezisztenciával rendelkező Zygomyces és Scedosporium fajok is. Egyre elfogadottabb az a nézet, hogy a multirezisztens kórokozók jelentette fenyegetés ellen a leghatékonyabban az infekciókontroll és a surveillance fejlesztésével lehet fellépni, melynek szerves részét képezi a modern mikrobiológiai diagnosztikai háttér: ez teszi lehetővé a beteg korai izolációját, a védőfelszerelés alkalmazását, az effektív terápia megkezdését. Vagy éppen ellenkezőleg – érzékeny kórokozó esetén – a szükségtelenül széles spektrumú, rezisztenciát és szövődményeket gyakrabban okozó, ráadásul drágább antibiotikum leváltása szűkebb hatásspektrumú célzott antibiotikumra. A kiemelt rizikócsoportba tartozó (többek között pl. hematológiai, traumatológiai, égési intenzív osztályon fekvő) betegek esetében a rutinszerűen ütemezett szűrés is hasznos [5]. DIAGNOSZTIKAI LEHETŐSÉGEK A hagyományos tenyésztésen alapuló multirezisztens baktérium szűréshez nagy segítséget jelentenek a szelektív kromogén táptalajok, melyek a leggyakoribb „superbugok” jelenlétére színelváltozással hívják fel a figyelmet [6]. IME XIV. ÉVFOLYAM 9. SZÁM 2015. NOVEMBER 41 LABORDIAGNOSZTIKA Régóta kaphatóak MRSA, ESBL és VRE 1-2 napon belüli kimutatására alkalmas táptalajok, újabban pedig – a felmerülő igényeket követve – megjelentek a karbapenemáz termelők detektálására alkalmas termékek is. Tenyésztés után, de még a részletes rezisztenciavizsgálatot megelőzően használhatunk különféle gyorsteszteket a karbapenemáz termelés vagy egyéb rezisztenciamechanizmus (ESBL, MRSA) megerősítésére. Általánosságban elmondható, hogy ezen módszerek nem helyettesítik a későbbi hagyományos rezisztencia vizsgálatot, de egy nappal korábban felvetik a multirezisztens kórokozó gyanúját és ezáltal lehetővé teszik a terápia korrigálását, esetleg a megfelelő megelőző intézkedések megtételét. Akár betegágy mellett az ápolók által közvetlenül a székletből is elvégezhető gyorsteszt nyújt segítséget a C. difficile vagy a gyakoribb enterális vírusok kimutatásában a hasmenéses megbetegedések differenciál-diagnosztikájában. A hagyományos, 16-24 órás tenyésztéses rezisztenciavizsgálatnál gyorsabb megoldások is sorra jelennek meg a diagnosztikai palettán. Ilyen úttörő technológia, a mátrix-segített lézer ionizációs repülési időn alapuló tömegspektrometria, röviden a MALDI-TOF MS. A MALDI-TOF a kórokozók fehérjéinek fizikai tulajdonságai (a töltés és a tömeg aránya) alapján teszi lehetővé a kórokozók azonosítását. Várhatóan a közeljövőben antibiotikum rezisztencia kimutatására is alkalmas lesz, ami kevesebb, mint 20 percen belül lehetővé teszi egyes „superbug" baktériumok elkülönítését az ugyanazon baktériumfaj érzékeny változatától. Mivel a mérés során nemcsak a kórokozók, de az egyes antibiotikumok jelenlétét is ki lehet mutatni, a rezisztencia szempontjá- 1. ábra A rész: egy karbapenem antibiotikum tömegspektruma (382. 975 m/z) és sói (405.193 m/z ill. 427.428 m/z) B rész: karbapenemázok által elbontott antibiotikum tömegspektruma (401.072 m/z) és nátrium sói (423.282 m/z, 445.583 m/z, 467.839 m/z) nyilakkal jelölve az inkubálásos vizsgálat során. Jaroslav Hrabák és munkatársai felvétele. Forrás: [7] 42 IME XIV. ÉVFOLYAM 9. SZÁM 2015. NOVEMBER ból kérdéses törzset az antibiotikummal együtt inkubálva megfigyelhető, képződnek-e az antibiotikum hasító enzimek működésére utaló metabolizált antibiotikum formák. (Sajnos, a negatív eredmény nem jelenti feltétlenül, hogy érzékeny-e az adott baktériumtörzs.) Ezen túlmenően járványügyi vizsgálatok is végezhetőek MALDI-val. Megfelelő számú izolátumból egy esethalmozódás során jó minőségű spektrumokat készítve alkalmas lehet korrelációs táblázat – egyfajta protein kapcsoltság – kimutatására az izolátumok között, ezzel alátámasztva a járvány gyanúját. (Fontos megjegyezni azonban, hogy egyelőre nem számít a MALDI-TOF járványügyi referencia módszernek.) Hasonlóan forradalmi és rövid időt igénylő analitikai rendszer a kolorimetriás (optoelektromos) film array. A módszer lényege, hogy egy nagy felületű membrán több száz vagy ezer különböző pontján bizonyos kémiai ágensekre, illetve molekulacsoportokra színreakciót adó más és más festékek vannak elhelyezve. Ha egy ilyen target molekula a membrán megfelelő mezőjére kerül, a felvillanó színreakciót rögzíti egy optikai érzékelő [8]. A felvillanások elhelyezkedéséből következtetni lehet az éppen detektált molekulákra is. Mikrobiológiában alkalmazva képes egy néhány órája növekvő (még szemmel nem látható) tenyészetből felszabaduló anyagcseretermékek molekuláit felismerni és azok alapján azonosítani a baktériumot, nem csak fajszinten, hanem akár a multirezisztens változatot is elkülönítve [9]. Megfigyelték továbbá, hogy a vizsgált baktériumok anyagcseréje antibiotikumok jelenlétében módosul, így tapasztalati úton lehetséges lesz a várható antibiogramot kisebb-nagyobb pontossággal megjósolni. Ez a technológia a mikrobiológiában még kiforratlan, több évnyi adatelemzésre van szükség a biztonságos használatához, de gyorsasága és egy vizsgálatra vonatkoztatott relatív alacsony költsége miatt idővel komoly segítség lehet akár a laborokban, akár a kórházi osztályokon. (Érdekesség, hogy külföldön egyes kórházakban betanított kutyák kiváló szaglását használják hasonló 2. ábra Az optoelektromos orr membránján megjelenő anyagcseretermékek megoszlása jó lehetőséget kínálnak a baktériumspeciesek azonosítására. Forrás: {10] LABORDIAGNOSZTIKA célra, a C. difficile asszociált hasmenésben szenvedő betegek azonosítására.) A baktériumgének jelenlétét kimutató molekuláris biológiai módszerek terén is intenzív a fejlődés. Eddig is lehetőség volt az egyes "superbugok" jelenlétére célzottan megvizsgálni a mintát, így a laboratóriumba érkezéstől számított néhány órán belül információt kaphattunk annak jelenlétéről. Ezt azonban minden egyes valószínűsíthető kórokozóra és azok rezisztenciagénjeire egyesével elvégezni reménytelen vállalkozás. Nem véletlen, hogy a multiplex PCR adta lehetőségeket kihasználva megjelentek az (adott betegségkategóriában, pl. sepsis) leggyakoribb 20-25 kórokozót, és azok egyes rezisztenciagénjeit is szimultán vizsgáló panelek. Az üzemeltetést leegyszerűsítve akár a betegellátó osztályon is elvégezhetővé vált a vizsgálat, ezáltal a mintavételtől számított egy órán belül eredmény várható. Hátránya, hogy jelenleg rendkívül drága. A molekuláris biológiai módszereknek alapvető szerepe van a járványok követésében. Költséghatékony, viszonylag könnyen kivitelezhető a nozokomiális terjedés igazolása a feltételezetten kapcsolódó betegek mintáiból származó kórokozók klonalitásának vizsgálatával. Ez legkönnyebben restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP) vagy multilokusz szekvencia tipizálás (MLST) segítségével erősíthető meg. A fentieken túlmenően mind gyakrabban végeznek teljes genom szekvenálást (WGS) a kórokozókon. Az igény lehet pusztán kutatásból fakadó, de pl. szokatlan rezisztencia és ismeretlen okú terápiás kudarc, vagy epidemiológiai probléma is felvetheti a genetikai háttér felderítésének szükségét. Természetesen mindez hiábavaló volna a megfelelő adatbázisok rohamléptű fejlődése nélkül. Széleskörű elterjedése a vizsgálat magas költsége, idő és munkaigénye miatt még évekig nem várható. Két távolabbi technológia fúziójaként jött létre egy manuális tenyésztést nem igénylő rendszer, mely a mintában lévő baktériumsejteket fluoreszcens hibridizációval azonosítja. A növekedés egyszerre 20-30 kazettában zajlik, folyamatos automatizált mikroszkópos megfigyelés és elemzés mellett (time-lapse microscopy) [12]. Mivel a rendszer képes felismerni az individuális baktériumsejteket, különféle antibiotikumot tartalmazó kazettákat is elhelyeztek a készülékbe, amelyekben a baktériumsejtek növekedése regisztrálható. A szaporodás gátlásának mértékéből ítélve egy inhibíciós görbe készíthető, és a baktérium viselkedése az adott antibiotikum jelenlétében néhány óra alatt jó közelítéssel megítélhe- 3. ábra Individuális baktériumsejtjeinek vizsgálata folyamatos automatizált mikroszkópiával. Bal oldalt az adott antibiotikumra rezisztens törzs telepeinek növekedéséről készült filmfelvétel egy pillanatképe látható, jobb oldalt pedig az érzékeny törzs nem szaporodó baktériumsejtjei figyelhetők meg. Gyártótól származó képek. Forrás: [13] tő. Természetesen emellett hagyományos tenyésztéssel is feldolgozásra kerül a minta, de a 2-3 órán belüli azonosítás és előzetes antibiogram felbecsülhetetlen segítséget nyújt a klinikus számára a terápia megtervezésében. Izgalmas megközelítés az élő vektorok felhasználása (egyelőre laboratóriumi körülmények között) a "superbugok" felismerésére és akár eliminálására [14]. Genetikailag módosított Lactococcus lactis baktérium természetes képességeit kihasználva egy kutatócsoportnak sikerült az Enterococcus speciesek cCF10 virulenciában és rezisztenciában egyaránt funkcionális regulátor feromonját triggerré alakítani a baktériumokat pusztító bakteriocin termelésre. Ezáltal a Lactococcus lactis cCF10 molekulák jelenlétében Enterococcusokra gátló hatású antimikrobiális peptideket kezd termelni, megakadályozva akár a VRE szaporodását is. A módszer kísérletes és kezdeti stádiumban van. ÖSSZEFOGLALÁS Bár a nozokomiális infekciók megfékezése – az anyagi és eszközi feltételeken túl – elsősorban infekciókontrolltól és a személyzet képzésétől várható; mégsem működhet a megfelelő mikrobiológiai háttér hiányában. Az eljövendő évtizedek limitált áttöréssel kecsegtetnek az új antibiotikumok terén, ezzel szemben a diagnosztika ígéretes innovációi révén talán lehetségessé válik az ésszerűbb és hatékonyabb antibiotikum politika, a korai izolálás, és a nozokomiális megbetegedések visszaszorítása. A pillanatnyilag elérhető diagnosztikus eszközök közül a legjobbat a mikrobiológiai laboratórium hivatott kiválasztani, viszont nélkülözhetetlen, hogy a klinikus gondoljon a szűrés fontosságára, és korai, adekvát mintát tudjon szolgáltatni a laboratórium számára. IRODALOMJEGYZÉK [1] WHO Library Cataloguing-in-Publication Data Report on the burden of endemic health care-associated infection worldwide, ISBN 978 92 4 150150 7, World Health Organisation, 2011. [2] Allegranzi B, Nejad SB: Burden of endemic healthcare-associated infection in developing countries: systematic review and meta-analysis, Published Online: 10 December 2010 DOI: http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(10)61458-4 IME XIV. ÉVFOLYAM 9. SZÁM 2015. NOVEMBER 43 LABORDIAGNOSZTIKA [3] ECDC Annual epidemiological report 2014 – Antimicrobial resistance and healthcare-associated infections, http://ecdc.europa.eu/en/publications/_layouts/ forms/Publication_DispForm.aspx?List=4f55ad514aed-4d32-b960-af70113dbb90&ID=1292#sthash. z7w538lJ.dpuf [4] Az Országos Epidemiológiai Központ Tájékoztatója a Nemzeti Nosocomialis Surveillance Rendszer (NNSR) 2014. évi eredményeiről, http://www.oek.hu/oek.web? to=1698&nid=841&pid=1&lang=hun [5] Frère P, Hermanne JP, Debouge MM, de Mol P et. al.: Bacteremia after hematopoietic stem cell transplantation: incidence and predictive value of surveillance cultures, Bone Marrow Transplantation, 2004, 33, 745–749. doi:10.1038/sj.bmt.1704414 [6] Perry JD, Davies A, Butterworth LA et. al.: Development and Evaluation of a Chromogenic Agar Medium for Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, J. Clin. Microbiol, October 2004, vol. 42 no. 10 4519-4523 doi: 10.1128/JCM.42.10.4519-4523.2004 [7] Hrabák J, Walková R, Študentová V, Chudáčková E, Bergerová T: Carbapenemase Activity Detection by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry, J. Clin. Microbiol, September 2011, vol. 49 no. 9 3222-3227 [8] Suslick KS,Bailey DP, Ingison CK, Janzen M, Kosal ME, McNamara WB, Rakow NA, Sen A, Weaver JJ, Wilson JB, Zhang C, Nakagaki S: Seeing smells: development of an optoelectronic nose, http://dx.doi.org/10.1590/ S0100-40422007000300029 [9] Carey JR, Suslick KS, Hulkower KI, Imlay JA, Imlay KR, Ingison CK, Ponder JB, Sen A, and Wittrig AEJ: Rapid Identification of Bacteria with a Disposable Colorimetric Sensing Array Am. Chem. Soc., 2011, 133 (19), pp 7571–7576 DOI: 10.1021/ja201634d [10] Askim JR, Mahmoudiab M, Suslick KS: Optical sensor arrays for chemical sensing: the optoelectronic nose, Chem. Soc. Rev., 2013,42, 8649-8682 DOI: 10.1039/ C3CS60179J 03 Jun 2013 [11] Price C, Douglas I, Tuttle E, Shorr A et. al.: Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of bacteria in bloodstream infections using the Accelerate ID/AST technology Denver Health and University of Colorado School of Medicine, Denver and Aurora, CO; Accelerate Diagnostics, Inc., Tucson [12] Douglas IS, Price CS, Overdier KH, Wolken RF, Metzger SW, Hance KR, Howson DC: Rapid Automated Microscopy for Microbiological Surveillance of Ventilator-associated Pneumonia American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Vol. 191, No. 5 2015, pp. 566-573. doi: 10.1164/rccm.201408-1468OC [13] Accelerate Diagnostic Inc. 3950 Tucson, AZ 85714, http://acceleratediagnostics.com/products/accelerateid-ast/ [14] Borrero J, Chen Y, Dunny GM, Kaznessis YN: Modified Lactic Acid Bacteria Detect and Inhibit Multiresistant Enterococci ACS Synth Biol, 2015, Mar 20; 4(3): 299–306. 2014. Jun 4. doi: 10.1021/sb500090b A SZERZÔK BEMUTATÁSA Dr. Iván Miklós Ábel, a Semmelweis Egyetemet 2012-ben végezte. A Laboratóriumi Medicina Intézet mikrobiológus szakorvosjelöltje, a dr. Kristóf Katalin vezetése alatt dolgozik. Fő érdeklődési területe a MALDI tömegspektrometria, a multirezisztens kórokozók, valamint az innovatív gyorsdiagnosztikai rendszerek alkalmazása. Dr. Vásárhelyi Barna 1992-ben végzett, klinikai laboratóriumi szakorvos. A Laboratóriumi Medicina Intézet intézetvezető egyetemi tanára. Fő kutatási területe a gyulladások pathofiziológiai mechanizmusa különböző krónikus kórállapotokban, illetve az ezek kimutatását segítő biomarkerek értékelése. Dr. Kristóf Katalin klinikai laboratóriumi szakorvos és mikrobiológus. A Semmelweis Egyetemet 1991-ben végezte el. A Laboratóriumi Medicina Intézet Klinikai Mikrobiológiai Diagnosztikai Laboratóriumát vezeti, egyetemi docens. Fő kutatási területe a fertőzést okozó multirezisztens mikróbák kimutatási lehetőségeinek és tulajdonságaiknak. Kiemelten foglalkozik az új mikrobiológiai vizsgálati módszerek bevezethetőségével, validálásával és hatékony infekció-kontrollal. 44 IME XIV. ÉVFOLYAM 9. SZÁM 2015. NOVEMBER